项目背景

　　尽管基于驱动基因的靶向治疗显著延长了晚期肺腺癌患者的生存期，但由于驱动基因突变仅出现在一部分患者中，从而限制了靶向药物的广泛应用。目前化疗仍在晚期肺腺癌多学科治疗中占主导地位。培美曲塞作为叶酸拮抗剂，能竞争性结合二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）抑制核苷酸代谢，阻断DNA合成，特异性杀伤增殖期细胞，2008年9月美国FDA和欧盟批准其应用于非鳞状细胞非小细胞肺癌的一线治疗。研究表明晚期肺腺癌一线治疗应用培美曲塞，中位生存期可达到12.6个月，疗效优于其他传统一线化疗药物，且毒副反应更小。培美曲塞维持治疗可使患者死亡风险显著降低22%，然而耐药的发生使培美曲塞在维持治疗中的应用陷入迷途困境。因此，阐明培美曲塞耐药机制是提高其疗效，解决耐药的关键。

　　1.1 DHFR扩增是培美曲塞耐药的主要途径

　　培美曲塞作为新一代叶酸拮抗药，与甲氨蝶呤、洛美曲索的结构类似，但是又具有显著的区别，培美曲塞能够阻断DHFR、甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶（GARFT）、5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸转甲酰酶（AICARFT）等多条细胞复制所必须的代谢途径。细胞内的叶酸酯有多条转运途径，由于结构与叶酸相似，抗代谢药能利用不同的运载体进入细胞内。其中DHFR可催化叶酸还原成四氢叶酸，其活性受到抑制后，二氢叶酸还原成的四氢叶酸减少，而细胞由于四氢叶酸及其一碳单位代谢酶衍生物缺乏，使嘌呤和嘧啶的合成障碍，引起细胞DNA合成受抑制，导致细胞发生凋亡。培美曲塞对细胞的敏感性主要取决于该药物细胞内蓄积浓度，任何造成细胞内浓度下降的途径都可能成为潜在的耐药机制。因此，培美曲塞耐药机制是多因素造成的。肿瘤细胞对培美曲塞产生的耐药机制可归为以下几方面：细胞对培美曲塞摄入量的减少；细胞对培美曲塞外排量的增多；细胞内培美曲塞多聚谷氨酸化水平的改变；培美曲塞靶基因DHFR的突变、扩增及过表达；以及Rb、p53、CyclineD等肿瘤相关基因的改变。其中靶基因DHFR的扩增及过表达是克服培美曲塞对叶酸代谢的抑制作用，维持DNA合成代谢活性的关键，是培美曲塞耐药性产生过程中最主要、最明显的改变。

　　1.2 E2F3通过DHFR调控多种肿瘤的增殖

　　E2F3属于E2F家族，定位于染色体6p22，全长91.5kb，其编码的E2F3转录蛋白由465个氨基酸组成，通过与细胞周期蛋白Dl形成二聚体参与调控细胞周期与DNA复制。E2F3 基因通过两个完全不同的启动子驱动两个相关基因产物的表达（E2F3a 与 E2F3b）。E2F3a 在增殖期细胞中表达，而 E2F3b 在增殖期和静止期细胞中持续表达。E2F3作为转录因子还可调控多个基因的表达，其中DHFR是E2F3a的靶基因之一。卵巢癌中研究发现表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）可使E2F3a表达增加，进而促进细胞增殖，阻断E2F3a可明显抑制细胞增殖。E2F3b拷贝数的增加导致了小鼠自发性肝癌。E2F3同样可驱动前列腺癌及膀胱癌的增殖及转移并能调控恶性黑色素瘤的发生与发展。有研究表明E2F3在人肺腺癌多西他赛耐药中起关键的调控作用，E2F3b可通过细胞增殖，细胞周期分布和细胞凋亡调节多西紫杉醇化疗敏感性。我们的前期工作中发现培美曲塞耐药者EGF、E2F3a、DHFR蛋白表达增加，但肺腺癌培美曲塞耐药模型中EGF、E2F3a、DHFR表达水平及其相关性仍然未知。

　　为了深化肿瘤领域研究开展，提升我国基础科研能力，响应国家不断深入并提升医疗水平的精神。北京医学奖励基金会特设立“EGF/E2F3a/DHFR信号通路调控肺腺癌培美曲塞耐药的作用机制研究”项目。

　　项目内容

　　本项目在前期工作基础上，采用分子细胞学方法结合实验动物模型，筛选与培美曲塞耐药产生相关的DHFR通路作为候选基因，并对其进行功能确认，进而绘制信号通路构架图。通过本课题的实施，有助于明确EGF/E2F3a/DHFR信号通路在培美曲塞耐药中的调控角色，并为阐明培美曲塞耐药机制提供理论依据。具体内容如下：

　　（1）构建耐培美曲塞人肺腺癌细胞系并检测其生物学特征；

　　（2）研究培美曲塞耐药细胞系中EGF/E2F3a/DHFR通路的作用机制；

　　（3）体内实验探讨EGF/E2F3a/DHFR通路作用。

　　项目对象

　　耐培美曲塞人肺腺癌细胞系及动物模型。

　　项目时间

　　自本项目启动之日起至2024年5月30日止

　　项目联系人

　　乔栋梁  联系电话：13811117387