项目背景

　　葫芦素属于葫芦科植物中四环三萜类化合物大家族，目前已发现并鉴定出50多种葫芦素类化合物，自然界中含量最高的是葫芦素B（CuB）和葫芦素E（CuE）。其中，CuE具有广泛的药理学和生物学活性，近些年，CuE的抗肿瘤效应引起人们越来越多的重视。有研究指出CuE是通过抑制不同的信号通路如Jak/STAT3通路、cofilin-1通路和mTORC1通路发挥抗癌作用，申请人前期研究表明，CuE可以通过激活PI3K/AKT/mTOR通路抑制食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移。另外有观点认为CuE可通过快速破坏肌动蛋白骨架发挥抗肿瘤活性。因此，CuE的作用可能涉及多种机制和多个靶点。目前，CuE抗肿瘤机制和作用靶点仍不太明确。有多项研究提示葫芦素与多种细胞的自噬诱导有关。目前关于CuE对肿瘤干细胞自噬的作用，尚未见报道。在预实验中申请人首次发现，在CuE的作用下，CD44+/CD24- ECSCs中自噬相关蛋白Beclin1、LC3、Atg3和Atg5的表达明显上调，同时我们发现PI3K/AKT/mTOR通路受到明显的抑制，提示PI3K/AKT/mTOR通路可能参与CuE调控ECSCs自噬机制。

　　磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白[phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /protein kinase B (AKT) /the mammalian target of Rapamycin (mTOR), PI3K /AKT /mTOR]通路参与肿瘤细胞多个生物学过程，以PI3K /AKT /mTOR为靶点的肿瘤治疗方案逐步成为研究的热点。在该通路中，PI3K存在于细胞质，可催化磷脂酰肌醇磷酸化（PIP3）。PIP3作为第二信使，与AKT相互作用使AKT 308位的苏氨酸磷酸化。激活的AKT蛋白再到胞浆中或者胞核内，通过磷酸化一系列底物发挥对细胞生理功能的调控作用，其中，mTOR是 PI3K信号通路关键的下游分子之一。PI3K /AKT /mTOR通路与细胞自噬密切相关。PI3K可与自噬基因 Bectlin-1结合形成复合体，从而使磷脂酰肌醇磷酸化产生PIP3，有助于自噬前体复合物和自噬小体膜的形成，激活型AKT可以下调Beclin-1基因的表达，从而抑制自噬，促进肿瘤的发生发展。此外，mTOR作为自噬启动阶段关键调节因子，其活化后可以磷酸化ATG13，干扰ATG13与U1K1/2和FIP200结合，抑制自噬体的形成。PI3K/AKT/mTOR信号通路在多种肿瘤细胞自噬中发挥了重要作用，为我们提供了非常有潜力的调控自噬的靶点。然而，关于PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤干细胞中的调控作用及靶向策略，目前尚未见报道。

　　综上所述，在ECSCs细胞中，CuE可以与PI3K相互作用抑制其磷酸化，阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路，诱导细胞发生自噬，导致ECSCs的生长、增殖和存活受到抑制。为了验证这一假说，本项目首先从食管癌细胞株中分离CD44+/CD24- ECSCs并进行培养，采用羟氯喹抑制自噬，采用雷帕霉素激活。

　　项目内容

　　（1）分析自噬对ECSCs细胞生物学功能的影响培养EC109食管癌细胞株，从中分离CD44+/CD24- ECSCs并进行无血清扩大培养。采用羟氯喹抑制自噬，采用雷帕霉素激活自噬。实验分组：未处理组、羟氯喹组、雷帕霉素组。采用透射电镜观察不同处理组及对照组细胞自噬体数量变化及分布情况；通过GFP-LC3评估自噬活性；采用RT-qPCR和wester-blot技术，检测各组中Beclin 1、Atg5、Atg14、Atg9及LC3等自噬相关标志物的表达；检测p62、LC3BI/II（自噬潮过程中关键蛋白）的表达变化，分析各组细胞中自噬潮的变化。在光镜下观察细胞形态，采用CCK-8检测各组细胞的增殖能力，采用流式细胞术分析细胞凋亡，Transwell实验分析细胞侵袭和迁移。

　　（2）分析CuE靶向PI3K/AKT/mTOR通路激活ECSCs细胞自噬的机制采用CuE处理ECSCs，采用LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR通路，采用Insulin激活PI3K/AKT/mTOR通路。实验分组：未处理组、CuE组、LY294002组、Insulin组、CuE+Insulin组。分析PI3K/AKT/mTOR信号通路（PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）的表达变化，分析细胞自噬水平的变化，分析细胞形态、细胞增殖、细胞凋亡、迁移和侵袭的变化。

　　项目对象

　　ECSCs

　　项目时间

　　自2023年1月至2026年1月

　　项目联系人

　　朱少敏 电话：15010624992