项目背景

　　1.1 国内外研究现状、研究意义

　　根据世界卫生组织（WHO）的报告，全球癌症发病率和死亡率正在迅速增长，是人类 70岁前死亡的主要原因。最新的2020年度全球癌症发病率和死亡率统计数据表明，每年全球新发癌症病人高达1930万例，并且有1000万人死亡。肺癌是世界上最致命和最常见的癌症类型之一。根据细胞来源，大约80-85%的肺癌患者为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）。根据其组织学特征，NSCLC又可以进一步划分为肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、鳞状细胞癌和大细胞癌。在大多数情况下肺癌没有单一的危险因素，目前已被证实与肺癌发病相关的因素有：吸烟、氡暴露、二手烟暴露、以及雾霾和室内空气污染等。根据WHO预测，至2025年如果不能采取有效的防治措施，中国每年肺癌的发病人数将达100万以上，给社会和家庭带来沉重的负担。在NSCLC的三种亚型中，LUAD最为常见，约占肺癌总病例的40%。因此，进一步加强 LUAD发病机理的研究，积极探索新的治疗靶点和治疗方法，仍然是当前肺癌防治中重大而迫切的课题。

　　1.2 转运RNA及肺癌

　　转运RNA（transfer RNA，tRNA）是由 73~90个核苷酸（nt）组成的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）。其一级结构具有稀有碱基；二级结构是经典的三叶草形状，由 D环、反密码子环、TψC环、D茎、反密码子茎、TψC 茎、氨基酸接受茎和一个可变臂组成。不同的tRNA可变臂长短不一，核苷酸数从二到十几不等。除可变臂和D环外，其他各个部位的核苷酸数目和碱基对基本上是恒定的，这些成分对维系tRNA三级结构的倒“L”型具有重要作用。tRNA的经典作用是携带氨基酸进入核糖体，以mRNA为模板，将其中具有密码意义的核苷酸序列翻译成蛋白质中的氨基酸序列。tRNAs除了发挥经典生物学功能外，可能还与转录后调控及肿瘤发生有关。

　　深度测序研究发现，肿瘤细胞中存在与microRNA（miRNA）长度相当的tRNA来源片段。这些片段分为两类：tRNA halves（tiRNAs）和tRNA-derived fragments（tRFs）。tRFs是由tRNA 衍生的长度为 14-30nt的RNA 片段，可分为 tRF-5、tRF-3 和来源于tRNA 前体3’端的tRF-1。研究发现，人细胞系中tRF-5和tRF-3极可能与 miRNA的功能相近：tRFs与Argonaute（Ago）蛋白有关，并且显示一类 tRFs由Dicer 酶切产生，一类靠 RNase Z作用。tRFs与人体多种疾病有关，并且在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的调控作用。它们通过对靶基因的调控参与机体的生物学过程，调节肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡等。但是，目前已经发现的tRFs的种类和数目有限，对其机制研究也不够全面。

　　1.3 tRF-25-R2IP4OI3FJ在LUAD中的可能机制探索

　　KMT2D（也叫MLL2或MLL4）是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶，在基因的表观遗传调控过程中起着关键的作用。小鼠和人KMT2D蛋白的长度分别为5588和5537个氨基酸。这两种蛋白质的重量约为600kDa。KMT2D含有酶活性C末端SET结构域，负责维持细胞中的蛋白质稳定性。有报道显示，在细胞分化进行前对KMT2D进行敲除，会降低细胞内H3K4me1/2的水平，抑制辅助转录因子及RNA聚合酶Ⅱ在基因上的富集，导致严重的基因表达异常，细胞分化发生缺陷。目前，研究发现的与KMT2D密切相关的癌症有淋巴癌、胰腺癌以及肺癌等[18-20]。在肺癌中，KMT2D的低表达抑制了增强子，包括抑癌因子Per2的超级增强子。因此推测：KMT2D在具体肺癌分型LUAD中同样可以通过调控一个抑癌因子的增强子，发挥其甲基转移酶的作用。

　　Varela I及其团队于2011年通过外显子组测序手段鉴定出肾癌中PBRM1基因的频繁突变，并发现PBRM1对 TP53，p21 以及可能的KRAS途径有调节作用。2018年1月份发表在《SCIENCE》的文献报道表明：PBRM1的缺失使得肿瘤细胞对interferon-γ更敏感，招募更多细胞毒性T细胞到肿瘤组织发挥抗肿瘤免疫效应。Miao等人将接受PD-L1单抗nivolumab治疗的35例转移性透明细胞肾细胞癌肿瘤样本、63例给予抗PD-L1或抗CTLA-4类似治疗透明细胞肾细胞癌肿瘤样本进行外显子测序，发现总生存期和无进展生存期延长的患者的共同特点是PBRM1缺失突变。PBRM1基因功能的缺失导致癌细胞上调了其他基因的表达，使得癌细胞对T细胞杀伤变得敏感，免疫治疗疗效更好。在国际顶尖杂志连续发表的2篇文章，都是关于PBRM1在免疫治疗中的作用，这引起本课题组对该基因在LUAD免疫治疗中的高度关注。

　　肿瘤实体并不仅限于肿瘤细胞，其中还包括多种驻留和浸润的宿主细胞及其分泌的细胞因子和胞外基质蛋白，共同组成了一个复杂的生态系统，被称作肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。癌细胞与周围环境的相互作用对肿瘤的进展有深远的影响，最终决定了肿瘤是否被清除，转移或建立休眠的微转移。靶向TME，特别是靶向TME中免疫细胞的免疫检查点抑制剂（PD-1/PD-L1和CTLA4抑制剂）的成功开发，已经成为了肿瘤治疗革命性的里程碑。近年提出的肿瘤免疫编辑学说将肿瘤免疫分为消除、平衡和逃逸三个阶段。消除期与免疫监视相同，免疫系统能识别并消除肿瘤。如果肿瘤完全清除，消除期结束。如果部分消除则进入平衡期。平衡期的肿瘤细胞保持休眠状态或发生进一步的基因变化引起抗原改变。如果某些变异的肿瘤细胞能耐受机体的抗肿瘤免疫应答，则进入逃逸期。临床诊断的肿瘤多处于免疫逃逸期。对于消除期的肿瘤细胞，Ｔ细胞可以通过筛査、寻找肿瘤特异性抗原，然后开始分裂增殖、活化，最终杀灭这一阶段的肿瘤细胞。但对于逃逸期的肿瘤细胞而言，上述过程则不能正常进行。PBRM1表达已被报道与CD8+ T细胞呈正相关。但鉴于TME的复杂性，LUAD中PBRM1仍可能通过其他机制促进生态位重建，因此需要进行更深入的研究。

　　为了深化肿瘤领域研究开展，提升我国基础科研能力，响应国家不断深入并提升医疗水平的精神。北京医学奖励基金会特设立“tRNA衍生的5'-tRNA-Ala-AGC-11-1_L25介导组蛋白甲基转移酶KMT2D的沉默调控PBRM1的转录参与肺癌免疫逃逸生态位重建的研究”项目。

　　项目内容

　　本课题重点研究了体内外5'-tRNA-Ala-AGC-11-1_L25的表达对LUAD免疫微环境的影响及其机制，同时明确了5'-tRNA-Ala-AGC-11-1_L251对LUAD免疫微环境的影响是依赖KMT2D/PBRM1通路的。其下一步的研究内容包括：

　　1.通过拯救实验研究PBRM1对于肺癌恶性行为的影响；

　　2.通过基础实验验证PBRM1的表达对于LUAD免疫逃逸生态位的影响；

　　3.研究tRF-25-R2IP4OI3FJ对KMT2D介导的RNA沉默对LUAD免疫逃逸生态位的影响。

　　我们研究的科学意义在于一方面拓展了tRF的生物学功能，另一方面为tRF与肿瘤免疫之间的相互作用提供了新的依据。

　　项目对象

　　本研究利用肺癌肿瘤细胞系进行相关实验。

　　项目时间

　　自2023年2月至2028年2月

　　项目联系人

　　朱少敏 电话：15010624992