项目背景

　　1.1 放射抵抗降低肺癌放疗疗效

　　肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位，其中肺癌中有2/3是非小细胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC）。近年来虽然手术、放疗、化疗以及靶向治疗等多学科都有所进展，但5年生存率仍不足20%。

　　放射治疗作为肺癌治疗的三大手段之一，约60%～70%的肺癌患者在治疗过程中需要接受放射治疗。但是相同分期的患者在放疗后其预后差异明显，存在着明显的异质性。其异质性与放射抵抗密切相关，因此，深入研究NSCLC放疗过程中放射抵抗的分子机制至关重要。我们的前期研究发现，核仁素是参与放疗抵抗的重要因子。

　　1.2 核仁素与放射抵抗

　　核仁素（nucleolin, NCL, C23）是目前发现的一种最重要的核仁蛋白。研究发现NCL参与肿瘤发生、发展的多个过程：（1）促进细胞的增殖与生长；（2）具有抗凋亡作用，NCL已被列为凋亡相关蛋白家族成员；（3）具有穿梭特性，穿梭于细胞核、细胞质和细胞膜之间，并发挥着重要作用；（4）通过与DNA、RNA或相关蛋白质结合，在DNA复制、重组和修复中发挥调控作用。（5）能够通过促进自噬细胞的活性来促进肿瘤细胞的生长。

　　当NCL表达减少时，就阻断了损伤因子的募集和DNA损伤修复过程。研究还发现，NCL可以与DNA DSBs早期的标志性分子γ-H2AX结合，并调节后续相关蛋白分子的募集。ChIP实验也验证了γ射线照射后NCL与DNA损伤位点的结合。

　　DNA损伤修复与放疗抵抗：放射治疗是通过高能X线、电子线、质子等多种射线对肿瘤细胞进行杀伤，其对细胞产生的直接杀伤作用是DNA损伤，即导致DNA单链或双链断裂，而DNA的双链断裂（double strand break，DSB）能引起细胞死亡。因此，双链断裂后能否得到有效修复是细胞能否继续存活的决定性因素。DNA双链断裂修复主要通过两种机制，即同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）和非同源末端连接（non-homologous end-joining，NHEJ）修复。当DNA损伤后，双链断裂如果未能及时修复，就会造成染色体缺欠，细胞死亡。

　　NHEJ通路中的主要成分有DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA dependent protein kinase catalytic, DNA-PKcs)、Ku70、Ku80、Artemis、DNA连接酶IV(DNA ligase IV)、X线修复交叉互补蛋白4(X-ray cross complementation group 4 protein，XRCC4)，其中DNA-PKcs是NHEJ通路中的主要决定因子。研究发现，抑制DNA-PKcs的表达能够减少肿瘤细胞的DNA损伤修复，从而提高肿瘤的放疗疗效。我们的前期研究发现，沉默NCL基因组，肺癌细胞放疗后的DNA损伤修复明显减少，是通过抑制DNA-PKcs磷酸化活性（尤其是S2056和T2609位点）来显著减少肿瘤细胞在放疗后的亚致死性损伤的修复，从而显著增加肿瘤的凋亡，减少了肿瘤细胞放射抵抗的发生。

　　自噬与放疗抵抗：自噬是细胞内蛋白质和细胞器破坏的溶酶体降解途径。虽然自噬是细胞内循环和代谢调节的内稳态机制，但自噬也是应激反应，它对清除受损的蛋白质和细胞器起着重要作用。细胞受到辐射时自噬起到保护细胞作用，维持细胞正常生理功能继而产生放射抵抗。自噬是肿瘤细胞的一种调节机制，它能使肿瘤细胞在应激状态下存活，其促存活作用能够促进肿瘤的形成。新的证据表明，自噬保护健康细胞，也可能是抑制肿瘤细胞增殖的关键。因此，如何确定自噬的功能状态是影响肿瘤发生和治疗肿瘤的关键，目前许多治疗癌症的方法也是针对细胞自噬的。

　　自噬的激活可能通过清除功能失调的细胞器和蛋白质以及维持能量平衡来提供细胞保护。在放射治疗或缺氧等条件下，自噬的生存功能可能有助于肿瘤细胞的存活和生长。显然，这种保护性自噬的形式也可以在肿瘤放疗中发生。在这种情况下，药理学或基因抑制自噬可以降低肿瘤细胞对各种治疗方法的抵抗性。在很大程度上，细胞自噬起到保护自身的作用，而抑制细胞自噬可以促进细胞凋亡。在放疗时，自噬是一把双刃剑，可以起到保护细胞或杀伤细胞的作用，这取决于肿瘤的类型、激活条件和DNA损伤的程度。

　　因此，自噬在肿瘤细胞的放射抵抗中起着至关重要的作用，了解和调节自噬途径将为癌症的治疗和预防提供新的途径。我们的前期研究发现，与对照组相比，沉默NCL基因组，放疗后的肺癌细胞凋亡数目明显增多，其机制可能是抑制了AKT的表达，从而抑制自噬的发生，导致肿瘤细胞凋亡。文献报道，AKT通过mTOR通路来抑制自噬的发生。因此我们推测NCL可能通过调控mTOR通路来调节自噬。

　　间充质干细胞与放疗抵抗：1867年，德国病理学家Cohnheimt首次提出假说，骨髓中可能存在非造血功能干细胞。1976年，Friedenstein等证实了间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）的存在，同时创建了贴壁法体外分离培养MSCs。MSCs属于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，其几乎存在于任何器官和组织中。当机体组织受到某种刺激时，一些“休眠”的MSCs被“唤醒”，归巢到损伤部位进行分化，替代损伤的细胞。大量研究发现，当机体缺血、缺氧和损伤时，机体内源性或者外源性MSCs具有向损伤部位优势分布的特质，提示MSCs具有强大的迁移能力，同时MSCs表面表达不同细胞因子受体，其与相应配体结合介导细胞迁移。

　　最新研究表明MSCs和肿瘤相关纤维母细胞具有许多相同的免疫表型，包括某些细胞表面分子，表明肿瘤相关纤维母细胞可能来源于MSCs，并可以向肿瘤相关纤维母细胞进行转化。MSCs在组织损伤时具有向损伤和炎症组织特异性趋化，以及修复组织损伤的潜能，在诱癌因素的作用下，具有干细胞特性的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）也可能发生异常分化和增殖，进而参与癌症的发生。目前对MSCs可以成为实体癌起源的观点仍未达成一致，MSCs在肺癌发生中的作用更是不清楚。我们的前期研究，在动物实验中发现，放疗杀伤肿瘤细胞后，出现了间充质干细胞向损伤部位的迁移，其迁移可能是参与损伤组织的修复，从而增加放疗抵抗，但具体机制仍不清楚。因此，我们推测，在放疗后，当肿瘤细胞发生损伤时，MSCs可以损伤部位迁移，与肿瘤细胞的自噬起到共同保护肿瘤细胞的作用。文献报道NCL可调控多向分化潜能干细胞的增殖、分化与凋亡。因此，我们推测，NCL可能对放疗后MSCs的迁移与分化具有调节作用。

　　为了深化肿瘤领域研究开展，提升我国基础科研能力，响应国家不断深入并提升医疗水平的精神。北京医学奖励基金会特设立“基于干扰核仁素研究放疗后mTOR通路对肿瘤细胞及间充质干细胞的调节机制”项目。

　　项目内容

　　本研究是哈尔滨医科大学附属肿瘤医院申办的基础研究项目，本项目在前期工作的基础上，拟阐述以下几个问题：1））采用分子细胞生物学方法，结合组织及动物模型，探讨核仁素在肺癌放疗抵抗过程中的作用；2）明确核仁素是否通过调控mTOR通路抑制DNA损伤修复和自噬来促进凋亡；3）明确核仁素是否通过调控mTOR通路调节间充质干细胞迁移、转化的潜在作用与调控机制。通过本课题的实施有助于阐明核仁素与肺癌放疗抵抗之间的关系；明确核仁素作为肺癌放疗抵抗药物靶点的潜在应用价值，为后续转化医学研究奠定基础。

　　项目对象

　　癌细胞系及相应的动物模型。

　　项目时间

　　自2020年10月至2024年9月

　　项目联系人

　　朱少敏 联系电话：15010624992